實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

大鼠鼻黏膜上皮分離自鼻黏膜組織；黏膜是覆蓋在機體內(nèi)消化、呼吸、泌尿、生殖等器官管腔內(nèi)壁的一層組織結(jié)構(gòu)，由上皮組織和疏松結(jié)締組織構(gòu)成。根據(jù)部位不同，有口腔黏膜、胃腸黏膜、鼻腔黏膜、氣管黏膜、陰道黏膜、眼瞼黏膜等不同名稱。它們的結(jié)構(gòu)也因功能、部位不一而不盡相同。鼻腔黏膜，簡稱鼻黏膜，覆蓋于鼻腔表面，黏膜下方為軟骨、骨或骨骼肌。根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的不同，鼻黏膜又分為前庭部、呼吸部和嗅部三部分。前庭部是鄰近外鼻孔的部分，有豐富的鼻毛可以阻擋空氣中較大的塵粒吸入。呼吸部占鼻黏膜的大部，有發(fā)達的上皮纖毛，它們可向咽部擺動，黏著有塵粒、細菌的黏液排向咽部，最終將它們排出體外。此外，此部分有豐富的血管與腺體，對吸入的空氣有加溫和濕潤作用。嗅部黏膜范圍較小，主要位于鼻腔頂部。它含有一種專司嗅覺的嗅細胞及嗅腺，它們分泌能溶解到達嗅區(qū)的含氣味的微粒，刺激嗅細胞表面上的嗅毛產(chǎn)生嗅覺，而且還由于嗅細胞具有不同的受體，可分別接受不同化學(xué)分子的刺激，因此可產(chǎn)生不同的嗅覺。

方法簡介：

實驗室分離的大鼠鼻黏膜上皮采用-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的大鼠鼻黏膜上皮經(jīng)Cytokeratin-18免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠鼻黏膜上皮體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的好培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠肌鈣蛋白T(Tn-T)檢測試劑盒 ，英文名： Tn-T ELISA Kit

Rabbit Bcl-2 associated X protein (BAX) ELISA Kit 兔Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)檢測試劑盒

牛(BCV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

CLIAKitforMouseSlit2ELISAKit小鼠Slit2

體液鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKit6-K-PG人6同前列腺素

SFRP2重組小鼠 sFRP2 蛋白 Protein

C-jun/AP-1 (Oncoprotein C-jun：active protein 1 0.5mgC-jun/AP-1 (Oncoprotein C-jun：active protein 1) 原癌基因蛋白(活化蛋白1)(抗原)

APEX1重組人 APEX1 / AP / APEx / Ref-1 蛋白 Protein

CAMK1G Protein Human 重組人 CAMK1G / CLICK III / CaMKIgamma 蛋白 (His & GST 標簽)

MCPT1 Protein Mouse 重組小鼠 MCPT1 蛋白

C-jun/AP-1 (Oncoprotein C-jun：active protein 1 0.5mgC-jun/AP-1 (Oncoprotein C-jun：active protein 1) 原癌基因蛋白(活化蛋白1)(抗原)

CAMK1G Protein Human 重組人 CAMK1G / CLICK III / CaMKIgamma 蛋白 (His & GST 標簽)

SFRP2重組小鼠 sFRP2 蛋白 Protein

MCPT1 Protein Mouse 重組小鼠 MCPT1 蛋白

APEX1重組人 APEX1 / AP / APEx / Ref-1 蛋白 Protein

鴨胱天蛋白酶9(Casp-9)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human ai hCG aibody (AhCGAb) ELISA Kit 人抗人絨毛膜抗體(AhCGAb)檢測試劑盒

HumanMotilin,MTLELISAKit 人胃動素(MTL)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforAcSDKPELISAKit大鼠N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯

血影細胞膜熒光染色試劑盒20次

Mouseplateletfactor3,PF3ELISAKit小鼠血小板因子3(PF-3)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

大鼠鼻黏膜上皮細胞（NO）測定試劑盒（還原酶法）

超氧化物歧化酶（SOD）分型測試盒（羥胺法）

微量二（MDA）測定試劑盒（TBA法）

—S轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）試劑盒（比色法）