產品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產品英文名稱：Huamn RANKL protein

產品中文名稱：重組人核因子κ B受體活化因子配體RANKL

規格：5 μg/20 μg/100 μg/1 mg

貨號：EY-01X8674
用途：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

標簽:無標簽

表達宿主:大腸桿菌

種屬:人

序列:氨基酸序列來源于人源： RANKL (Ala142-Asp317)（O14788）表達的蛋白片段，C-末端帶有 6×His 標記。

活性:通過其在 RAW264.7 細胞中誘導破骨細胞分化的能力來衡量。這種效應的ED50<10 ng/mL。

蛋白長度：該蛋白質的計算分子量為 20.67 kDa，在還原條件下，蛋白質遷移為 17 kDa（SDS-PAGE 分析）。

純度:> 98 % ，使用SDS-PAGE檢測

采用 LAL 法檢測，每 1 μg 蛋白質中的動?動

背景

NF-κB 受體激活劑（RANK）配體（RANKL）是 TNF 細胞因子超家族中的 II 型跨膜蛋白，其細胞外結構域位于 TNF 細胞因子超家族的羧基端。RANKL 是一種 19.8 kDa 的蛋白質，含有 317 個殘基，在 T 細胞和 T 細胞豐富的器官（如胸腺和淋巴結）中高表達。RANKL-RANK（RANKL 受體）在骨代謝、失調和免疫系統中發揮著重要作用。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臜產物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數后可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

(二)構建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

(四)誘導表達

1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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