使用方法:
一、樣品 DNA 的制備
用自選方法提取 Cps DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備 Cps 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DN**段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到10E7 拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。
4. 在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 Cps 陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。
5. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5拷貝/μL 的陽性對照。
6. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6個(gè)稀釋度的陽性對照。
7. NC 管中不加任何陽性對照。
8. 從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見下步），每個(gè)樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個(gè)陽性對照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值，并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參數(shù)規(guī)格：

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
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檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

顏料橙13Pigment orange 13：623.49 C32H24Cl2N8O2：3520-72-7

4-(2-代乙酰)-2,2,6,6-四甲-1-氧自由：339.24- (2- iodobenzofuran carbamoylmethyl) -2,2,6,6- four -1- methyl piperidine oxygen radicals：25713-24-0 C11H20IN2O2

何首烏苷Polygonum multiflorum glycosides：406.39C20H22O9：55327-45-2

5--6-硝喹啉：189.175- amino -6- nitro group：35975-00-9 C9H7N3O2

4-二甲-1-新戊氯吡鎓：228.764- two -1- dimethylamino neopentyl pyridinium chloride：109911-77-5 C12H21ClN2

氟鋯酸鉀：283.3904Potassium fluoride：16923-95-8 K2ZrF6

5-溴-2-氯-4-(甲氧)-嘧：299.555- -2- -4- (phenyl group) - - - - - - -：205672-19-1 C11H8BrClN2O

4-(2,4-二氯芐氧)-1,3-二甲-5-吡唑甲磺酸鹽：439.314- (2,4- two) -1,3- two methyl -5-：58011-68-0 C19H16Cl2N2O4S

長春地辛Changchun notes：753.93C43H55N5O7：53643-48-4

肥胖帶絳蟲LAMP試劑盒食蟹猴 IL6ST / gp130 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠 CD153 / CD30L / TNFSF8 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠 PVRL2 基因全長ORF克隆

人 PD1 / PDCD1 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶Myc標(biāo)簽

人 CSNK1G3 轉(zhuǎn)錄變體3 基因全長ORF克隆

小鼠 PDCD2L 基因全長ORF克隆

人 EVI2A 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 SHC4 基因全長ORF克隆

大鼠 Cripto / TDGF1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 TUBB 基因全長ORF克隆

人 IGFII / IGF2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽

人 IL36G / IL1F9 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽